ЧКД от подготовки сред - до брожения пива

ЧКД от подготовки сред до брожения пива.
Начну с подготовки сред.

 

Немного теоретических данных (выдержки из методических указаний к лабораторной работе по биологии микроорганизмов).
К питательным средам предъявляются следующие требования:
1. Они должны содержать источники азота и углерода, неорганические соединения, микроэлементы, а также факторы роста, витамины, в основном группы В. В качестве универсального источника азота используют пептоны. Пептоны – это продукты гидролизного расщепления мяса или казеина. В них содержатся полипептиды, аминокислоты и основные минеральные вещества. В качестве универсального источника углерода в питательные среды добавляют углеводы (сахара) – глюкозу, лактозу, сахарозу; органические кислоты – молочную, лимонную и др.; многоатомные спирты – манит, глицерин, сорбит и др.
2. Питательные среды должны иметь определенную реакцию среды.
3. Питательная среда должна быть стерильной, т.е. не содержать микроорганизмов.
4. Питательная среда должна быть влажной, так как питание у микроорганизмов осуществляется по законам диффузии и осмоса. Многие среды должны быть прозрачными для того, чтобы можно было различить на них рост микроорганизмов и наблюдать за физиологическими изменениями, происходящими в результате их жизнедеятельности.

Стерилизацией или обеспложиванием (sterilis- бесплодный)называют полное уничтожение вегетативных клеток микроорганизмов и их спор в каком – либо материале (питательной среде, посуде, приборе, инструменте, перевязочном материале и т.д.). Выбор способа стерилизации зависит от свойств стерилизуемого объекта.

Автоклавирование. Питательные среды стерилизуют главным образом в автоклавах насыщенным паром под давлением 0,05-0,2 МПа. Температура насыщенного пара при различных давлениях показана ниже:

Показатели манометра, МПа ............................ 0,00..... 0,05..... 0,10

Температура насыщенного пара, ºC ....................100..... 112 ......... 121

Показания манометра, МПа ................................. 0,15 ....... 0,20....... 0,30

Температура насыщенного пара, ºC ....................... 128....... 134......... 144.

Стерилизация стеклянной посуды
Стеклянную посуду стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 165-170 ºC в течение 1,5-2 ч или путем автоклавирования. Посуду перед стерилизацией тщательно моют и высушивают. Пробирки и колбы закрывают ватными пробками. Пробки завертывают по 10-20-40 шт в бумагу. На колбы надевают бумажные колпачки, предохраняющие горлышко от пыли. Чашки Петри завертывают в бумагу каждую отдельно или вместе по 2-3 шт.
Подготовленную посуду размещают на решетчатых полках в сушильном шкафу или загружают в автоклав, но не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию горячего воздуха или сухого насыщенного пара и равномерный нагрев посуды. Сушильный шкаф должен быть плотно закрыт. Если шкаф не снабжен терморегулятором, необходимо все время следить за температурой. Повышать температуру более 175 ºC не следует, так как бумага и пробки начинают разрушаться. Чтобы предохранить посуду от растрескивания, по окончании стерилизации сушильный шкаф охлаждают до 100-70 ºC, после чего посуду можно вынимать. Для сохранения стерильности посуду разворачивают непосредственно перед работой.

Стерилизация инструментов и приборов
Для стерилизации мелких металлических инструментов (петли, иглы, ланцеты, пинцеты, ножницы) применяют прокаливание в пламени горелки или спиртовки (фламбирование) непосредственно перед использованием. На пламени кратковременно обжигают горлышки пробирок, колб, бутылок, а также ватные пробки при пересевах культур и разливе сред. В пламени погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов.
Приборы для культивирования микроорганизмов, детали к этим приборам, резиновые пробки, соединительные шланги стерилизуют автоклавированием, предварительно завернув в плотную бумагу.
Чистые центрифужные пробирки, изготовленные из термолабильных пластмасс, стерилизуют ультрафиолетовым облучением (мощность лампы 15 Вт, длительность обработки устанавливают экспериментально) и хранят в стерильной посуде.

Автоклав
Образующийся пар должен вытеснить из автоклава весь воздух, так как температура чистого насыщенного пара выше температуры смеси пара с воздухом. После полного удаления воздуха и влажного пара непрерывную струю свистящего сухого пара выпускают еще 10-15 мин и перекрывают спускной кран. Пар выпускают через резиновый шланг, надетый на пароотводную трубку и опущенный в сосуд с водой. За повышением рабочего давления в автоклаве следят по манометру. Время стерилизации отсчитывают с момента установления необходимого давления. Излишний пар, образующийся в результате нагрева, выпускается предохранительным клапаном, как только стрелка манометра переходит черту требуемого давления.
По истечении времени стерилизации автоклав выключают из электрической сети, нагревание прекращают и ждут момента, когда давление по манометру упадет до нуля. Только после этого можно открыть спускной кран, осторожно выпустить из автоклава остаток пара, затем отвинтить и откинуть крышку. Если спускной кран открыть раньше, чем стрелка займет нулевое положение, может произойти бурное вскипание жидких сред и смачивание ватных пробок. Резкое снижение давления может привести к выталкиванию пробок и даже выплескиванию жидкости из сосудов. Нельзя преждевременно отвинчивать и открывать крышку, так как вырывающиеся струи пара могут вызвать ожоги обслуживающего персонала и окружающих. Автоклаву дают несколько остыть и вынимают простерилизованный материал. Оставлять автоклав закрытым до полного охлаждения не рекомендуется, так как пар конденсируется и влага пропитывает ватные пробки. В нерабочем состоянии автоклав держат открытым и свободным от воды. Для проверки стерильности питательные среды помещают на 2-3 сут в термостат при 30ºC, и если обнаруживают рост микроорганизмов, среды готовят заново.

Другие виды стерилизации
Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация). Данный способ применяют для стерилизации питательных сред, изменяющих свой состав и свойства под действием температур выше 100 ºC. Сущность дробной стерилизации состоит в том, что нагревание среды (или ее компонентов) проводят при 100 ºC три раза по 30 мин трое суток подряд. Кратковременное прогревание среды кипячением уничтожает в основном термолабильные вегетативные клетки микроорганизмов. Поэтому между нагреваниями питательные среды выдерживают при комнатной температуре (или в термостате при 30 ºC) и дают возможность прорасти оставшимся жизнеспособным спорам. Образовавшиеся из термоустойчивых спор вегетативные клетки погибают при повторном кипячении. Продолжительность нагревания может быть увеличена до 45-60 мин, что зависит от объема жидкости.
Дробную стерилизацию питательных сред проводят в аппарате Коха или в автоклаве с закрытой, но не завинченной крышкой. Так как нагревание ведут в парах кипящей воды, способ называют стерилизацией текучим паром. Дробной стерилизации подвергают среды, в состав которых входят сахара, многоатомные спирты, желатин.

Стерилизация путем прерывистого нагрева была предложена английским физиком Джоном Тиндалем и получила название тиндализации. Среды необратимо изменяющиеся при кипячении, осторожно прогревают при более низкой температуре: при 60-80 ºC в течение 5 сут подряд по 30-60 мин или при 56-58 ºC на протяжении 6-7 сут, в первые сутки – 2 ч, в последующие – по 1 ч. Температурную обработку сред ведут на водяной бане или в ультратермостате, где температура автоматически поддерживается на определенном уровне с помощью специального устройства. В промежутках между нагревами среды выдерживают в обычном термостате при 30 ºC.

Пастеризация. Пастеризация, или неполная стерилизация, предложена Луи Пастером. Она предназначена для уничтожения в основном аспорогенных микроорганизмов однократным прогреванием при температуре 60-75 ºC и выдержке 15-30 мин или при 80 ºC в течение 10-15 мин. Пастеризации подвергаются продукты и среды, которые при воздействии боле высоких температур претерпевают глубокие изменения, теряют качество и питательную ценность. Пастеризацию широко применяют в пищевой промышленности.

Стерилизация фильтрованием. Стерилизацию жидких питательных сред, не выдерживающих даже незначительного нагревания, производят фильтрованием через специальные мелкопористые бактериальные фильтры. На бактериальных фильтрах задерживаются механические взвешенные примеси, в том числе и клетки микроорганизмов. Исключение составляют вирусы и фаги. Фильтрованию подвергают среды с белками, антибиотиками, витаминами, летучими веществами, а также культуральные жидкости с целью освобождения от клеток и сохранения всех продуктов метаболизма в неизменном виде. Фильтры изготавливают из положительно заряженных материалов.

 

Кратко по теории пока все.
Прочитав ее сразу приходит в голову мысль: у меня квартира, а не лаборатория.
Зато в моем распоряжении кухня! Да, жена иногда смотрит косо
1. Для стерилизации сухим жаром при +170С практически у каждого имеется духовой шкаф, у меня электрический. И слава богу! В отличии от газового равномернее создает жар.
2. Автоклав? Тоже легко. У многих ведь имеется скороварка. У меня не было. Пришлось заказать где-то в интернет магазине. Выбор пал на скороварку из нержи объемом 9л + дополнительная стеклянная крышка в комплекте + две запасные силиконовые прокладки под крышку. Металлическая крышка скороварки при затягивании держится за "уши" снаружи. Это надежнее. Бюджет что-то в районе 4т.р. Купив данный аппарат я удивился - как я раньше без него обходился? Он теперь выполняет три вещи: автоклав, парогенератор, 9л кастрюля для отварок несоложенки, а так же для декокции. Ну да я отвлекся.
Собственно переделка коснулась только аварийного клапана - точнее его изъятия. Подсказал один человек на нашем форуме. В канал этого штуцера просунут кусок силиконовой трубки ф4мм. Как оказалось при вставке туда щупа электронного термометра(будет виден дальше) мы решаем две задачи - герметичность и замер температуры вместо давления. Нет необходимости врезать манометр. Остается подобрать дополнительный грузик на штатный рабочий. Рабочий кстати у этой скороварки срабатывает ~при 112-114С, а это уже 0,05МПа. Неплохо бы еще подобрать кран с маленькой резьбой, так чтобы его ввернуть в крышку, а в него ввернуть штуцер с рабочим грузиком. Это на будущее.

 

Для подготовки сред мне потребовалось:
1. Сусло. Можно затереть солод в мешочке небольшую партию, можно сварить из сухого экстракта (удобно, но дорого), можно взять от сваренных предыдущих партий. Из экстракта я не пробовал.
2. Агар-агар в порошке. Подойдет пищевой. Щас его двух видов продают в Райте. Я покупал в Комсомолле(Екатеринбург) Цена - 50-60руб за 10гр.
3. Рефрактометр
4. Пипетка мерная.
5. Пробирки. У меня 7мл под уклоны, 15мл под сусло.
6. Бутыльки 100мл. В них я готовлю стерильное сусло для первого перелива (пока не по теме).
7. Мерный цилиндр от ареометра.
8. Чашки Петри стеклянные. У меня ф80мм.
9. Кухонная утварь.
10. Штатив для пробирок.
11. Пульверизатор с 70% спиртом.
12. Фольга пищевая алюминиевая.
13. Фильтр обезпложивающий
Что забыл, по ходу допишу.

По вопросам того, почему для выращивания ЧКД используется ячменное сусло, агар-агар, их соотношения, плотности - описывать я не буду. Информация взята с нашего форума, интернета. Хорошие книги по дрожжам на английском языке. Попереводить можно, но так как беглого владения языком нет - долго и пока нет времени. Некоторые основные моменты переведены и ими можно воспользоваться. Спасибо форумчанину Saschai

 

Сусло. Достал из холодильника замороженное сусло от последней варки Биттера. Охмеленное. Плотность 1,042. Мутноватое.
Разморозил, согрел до комнатной, ставлю его кипятиться в кастрюльке. Эта операция не для стерилизации, а для очистки. Перед нагревом вливаю в кастрюльку яичный белок от 1-го яйца (много для такого объема, но не делить же), хорошенько его пытаюсь растворить в теплом сусле, нагреваю. . тут главное не сварить белок раньше времени.

Довожу до кипения. 5 минут достаточно. . Фильтрую . В результате чистейшее сусло
Плотность его 1,045 объем 300мл. Разводим по правилу креста плотность в итоге 1,040SG. Остужаю.

 

Теперь о плотности.
Принято, что сусло для сусло-агара, для переливов и стартера(на будущее) готовится плотностью 1,040 SG.
Сусло, для внесения колоний в пробирку с чашки петри или уклона готовится плотностью 1,020 SG.

В данном опыте делал среды для: 4-х пробирок с суслом, 4-х пробирок с сусло-агаром, 80мл сусло-агара для дальнейшего налива в чашки петри и что останется - сусло на бутыльки для первого перелива по 40мл.
Вообще лучше планировать операцию на большее кол-во пробирок, что б не заморачиваться часто. Стерильные среды хранятся очень долго без проблем. Одна проблема есть конечно - потемнение сусла (реакция Майяра).

Да, по ходу дополнения:
1. Способ стерилизации сред выбран автоклавированием, а чашек петри - сухим жаром.
2. Я пока занимаюсь процедурой подготовки сред для выведения ЧК и их сохранения. Размножение дрожжей для брожения посредством стартера или без него... - совсем другая тема.

 

Беру мерный цилиндр. Отливаю туда 20мл приготовленного сусла (20 потому что меньше нет градуировки). Разбавляю пополам водой. Имеем сусло плотность 1,020.
Пипеткой разливаем в 4 пробирки по 5мл.

Беру 100мл приготовленного сусла. Выливаю в кастрюлю. Рассыпаю по поверхности порошок агар-агара в % содержании ~2%. То есть 2гр и даю набухнуть ему 15мин.

Стерильности пока нигде нет.

 

Начинаю нагревать сусло с агаром до кипения. В это время штатив с пробирками и пипетку подтаскиваю к плите. Дал закипеть на медленном огне помешивая. Снимаю ставлю пару раз. Порошок вроде растворился. Наливаю в стакан кипяток (для промывки пипетки).
Выключаю плиту. Кастрюлю не снимаю, разливаю пипеткой по4-м пробиркам. Опытным путем вывел, что нужно мне сусло-агара для такой пробирки где-то 2,7мл. Срочно промываю пипетку кипятком, иначе потом придется приложить усилия для ее помывки. Остатки сусло-агара выливаю в бутылек. . Его видно - он темнее.
Остатки ранее приготовленного сусла разлились по 5-ти бутылькам. С синими крышками - автоклавируемая посуда. . А коричневые фунфырики - это из под спирта медицинского. Там прокладка под крышкой не знаю из чего. Вот для эксперимента решил ее испытать в автоклаве.

 

Готовлю свой "автоклав".
На дно нужно какую то подставку делать. Ну пока так. Наливаю где то 1л воды. Расставляю бутыльки, пробирки в баночках. Пустые банки для заполния пространства, т.к. есть опыт опрокидывания.
Все крышки на емкостях завернуты слегка для доступа пара!!! . В скороварке вместо одного бутылька с синей крышкой появился плоский бутылек - там под крышкой уже проверенная силиконовая прокладка. Плотно закрываю крышку скороварки, периодически руками надавливая по всему периметру. Если крутить только барашком, то прилегает не до конца плотно и травит чуть после 0,05МПа.
Нагреваю со снятыми грузиками до кипения и жду пока пойдем более-менее сухой пар и даю ему выходить 15мин, выгоняя воздух. .
Установил после истечения 15мин грузы на штуцер. Давление быстро доходит до 1 атм.
Убавляю мощность, таймер на 15мин.
По звонку таймера выключаю плиту, жду когда давление в скороварке упадет до наружного, а это значит - 100С. Снимаю грузы все, пар не идет. Быстро поставил на штуцер фильтр, т.к. при остывании внутрь скороварки будет засасываться воздух извне. .
Жду остывания до 50-60С. . Обработал из пульвера со спиртом по кругу крышку скороварки, руки, побрызгал на поверхность плиты. Быстро снял крышку со скороварки и быстро заворачиваю плотно все крышки на бутыльках и пробирках (не дышу).

 

А перед этим подготовил на столе фольгу и то, на что буду наклонять пробирки с сусло-агаром, спрыснул спиртом. Кладу пробирки так, чтобы среда заняла где-то 2/3 ее длины. Остужается все лежит.
По остывании всего обматываю все и на всем пробки изолентой.
Результат: . Стерильные среды. Но, как советуют - поглядеть на них нужно дня через 3 - чистые ли? Поэтому ждем, ничего не делаем

Прокладки на спиртовых фунфыриках ни к черту. При 120С они расплавились . Сусло из них слил в ПЭТ и в морозилку.

Сусло-агар в бутыльке получилось 70мл. Это должно хватить на 4 моих 80мм чашек. Разливать буду позже. Как только понадобится - ставим флакон в микроволновку и малыми шагами греем, лучше на разморозке.Можно наверное на бане расплавить. Разливать все сразу. Стерилизовать повторно говорят нельзя, т.к. сильно ухудшается затвердевание.
Чашки тоже пока не стерилизуем.
Продолжение следует...

 

А потом задаться вопросом, как удалить конденсат из пробирок с уклонами? )))

 

Прошло 3,5 суток хранения при температуре +25С. Сусло в бутыльках чистое, прозрачное, незначительный осадок имеется. Сусло-агар в бутыльке для чашек чистый. Конденсата внутри вообще нет.
Пробирки с суслом чистые. Пробирки с сусло-агаром тоже чистейшие. .

 

Разглядываю пробирки с уклонами. На стенках конденсата стало гораздо меньше. Медленными покачиваниями пробирки заметно, что на дне есть мизерное количество стерильной конденсационной воды. Ее пока и каплей не назовешь. Пусть она и остатки стерильного конденсата там и "живут". Они не помеха. .
Убираю все в более прохладное место до необходимости. Пробирки с уклонами храню вертикально.

 

Зачем, он абсолютно не мешает если хранить уклоны вертикально в штативе или пищевом контейнере в виде стакана, от этой капли на дне уклона даже польза - в пробирке влажность - поверхность посеянной колонии не сохнет.

А это то зачем, сначала душили микробиоту а потом потенциальный ее рассадник поближе к горлышку намотал? Изолента вообще не аналог "парафильма". Тоже раньше каждый уклон мотал, правда в пищевую пленку "для лучшей стерильности", сейчас храню без всяких обмоток в хорошем герметичном (условно конечно) пищ. контейнере и все ОК, на прошлой неделе разводил сейзоновский уклон со сроком посева август 2015 г!!! Завелись как миленькие, посторонних вкусов запахов в "отработке" нет, отличный стартер вышел.

 

Alexor. Точно изолента - не парафилм, пленка пищевая с тем же успехом . Согласен, все-таки обматывать наверное нехорошо. Учтем.
Забегая вперед: срок хранения культуры agar slant(уклон по нашему) при температуре +3С :надежный - 3 месяца, максимальный - 1-2 года. Поэтому желательно пересеивать коллекцию культур каждые 3 месяца, иначе есть шанс что дрожи начнут мутировать. Кроме того, после несколько циклов "уклон- сусло в пробирке- стартер" культура тоже начинает деградировать. Желательно снова проводить операцию селекции на чашках Петри - agar plate. На чашках надежный срок хранения - 1 месяц, максимальный - 1 год при условии герметичности. Что имеется ввиду, я не знаю точно(английское слово "sealed"), наверное в в пленку завернутые ил какие-нибудь стерильные пакеты. .
Наверное это все в идеале. Опыта на такие сроки хранения пока нет у меня.

 

У меня технология такая: уклон сею в 2 пробирки через сутки 1 пробирку - на стартер, 2 - на чашку. Использованный уклон в каналию, стартер в пиво, чашку на новый уклон. Так и обновляюсь, варюсь не часто, а в коллекции штаммов 6-7 как раз хватает на обновление 1-2 раза в год.

 

Я чуть по другому хочу настроиться: Штамм хранить в 2-х уклонах (пока на одном)- один рабочий, другой контрольный. А вот с уклона засеиваю в одну пробирку перед готовящейся варке. Из забродившей пробирки петлей на чистый уклон, а саму пробирку далее для стартера.

 

Неее, я на уклон только прыщик с чашки, зато всегда уверен что у меня на уклоне "селекционный" чкд.
Правда о селекции в домашних условиях нужно говорить с большой натяжкой

 

А сколько ты прыщиков селишь с чашки в пробирку? Или ты с чашки всегда один прыщик в уклон и все?

 

Ага, одного хватает, размазал его, через 2-3 дня пробирку в холодильник, и до след. раза